Vi sinh vật có thể tự nhiên sinh sôi không?
Chính vào thời điểm này, ở Italia đã xuất hiện một nhà khoa học tên là Lazzaro Spallanzani. Spallanzani cho rằng, khuyết điểm của Niderhan có thể xuất hiện ở khâu đun nóng trong 5 phút này, nếu như 5 phút không đủ để giết chết tất cả các vi sinh vật ở trong bình, vậy thì kết quả này là bình thường. Bởi vậy, ông Spallanzani đã phỏng theo phương pháp của Niderhan để làm một cuộc thực nghiệm, ông đổ nước thịt cừu vào trong mấy bình, sau khi đun nóng bịt kín miệng bình, trong đó một bình đun nóng 5 phút, các bình còn lại đun nóng 1 giờ.
Vài ngày sau, Spallanzani đã kiểm tra, nhận thấy trong bình đựng nước thịt cừu đun nóng 5 phút thì có đầy vi sinh vật, còn trong bình đựng thịt cừu đun nóng 1 giờ thì không có sự tồn tại của bất kì vi sinh vật nào. Sự việc đến đây đã được chứng minh rất rõ ràng rồi, nhưng Niderhan đã phản kích lại: “Đun nóng 1 giờ khó mà làm cho vi sinh vật sinh sôi tự nhiên sợ mà chết hết sạch được, hơn nữa, Spallanzani dùng phương pháp khi đun nóng bịt kín bình, e rằng đã đẩy hết không khí trong bình ra ngoài, trong trạng thái chân không thì vi sinh vật tồn tại làm sao được”?
Hiển nhiên là Niderhan đã đuối lí, do vi sinh vật đã có thể phát sinh tự nhiên thì sẽ không cần tới điều kiện nước đã đun nóng bao lâu, vấn đề chỉ là trong trạng thái chân không thì kết quả thực nghiệm liệu đem lại cùng một kết quả không. Trong trường hợp này, Spallanzani khi tiến hành cuộc thực nghiệm tiếp theo, đặc biệt chú ý khi bịt kín bình tránh để không khí lọt ra ngoài, kết quả chứng minh là hoàn toàn giống nhau, như vậy, cuối cùng Niderhan đã không thể nói vào đâu được nữa.
Năm 1860, nhà khoa học kiêm nhà vi sinh vật học nổi tiếng người Pháp, Louis Pasteur đã thiết kế một cuộc thực nghiệm hợp lí hơn. Ông đổ nước thịt đun nóng vào bình chịu nhiệt cổ dài và cong, vừa không hạn chế sự ra vào của không khí, cũng không đun nóng bình, kết quả phát hiện ra vi sinh vật đều dính lại phần cong ở cổ bình, còn trong bình không có sự xuất hiện của vi sinh vật. Rõ ràng, vi sinh vật xâm nhập vào từ trong không khí, từ đó đã phủ định triệt để thuyết phát sinh tự nhiên.